항균 시험법의 결정에 도움을 드리기 위한 자료입니다.

Ⅰ. 항균 시험 소개

1. 항균 시험 개요

2. 항균활성 평가 (paper disc법)

(1) 시료의 적용농도 결정 및 stock solution 제조

분양 정보에 따라 제공된 시료는 용매를 사용하여 최고 용해도로 stock solution을 제조함

Kirby Bauer의 디스크 확산법(Kirby Bauer Disk Diffusion Method)에 따라 시험을 실시함

❍ 세부 시험방법

① 균액의 조제 및 도말

- 시험대상 균주는 권장 배지인 Mueller Hinton broth 및 Potato dextrose broth에 접종하여 각 배양 온도에서 전배양 함

- 박테리아 및 칸디다균은 2회 계대 배양을 거친 후 0.5 McFarland standard 용액과 유사한 수준의 탁도로 균액을 희석하여 실험용으로 준비함 (McFarland 표준은 박테리아 밀도를 시각적으로 비교할 수 있는 황산바륨 또는 라텍스 입자의 현탁액으로 0.5 McFarland standard 용액의 625nm에서 흡광값 0.08~0.13의 수치는 E.coli 기준 1x10⁸ ~ 2x10⁸ CFU/㎖ 수준의 균 생장 정도와 일치함)

- 항균 시험 시점에서 미생물의 생장 단계는 대수증식기 (log phase)에 있어야 하므로, 전날 계대 배양 뿐만 아니라, 당일 탁도 조정 후에도 15분 이내로 균액을 사용하여야 함

- 0.5M McFarland standard 용액과 유사한 수준의 탁도로 준비된 균액은 멸균 스왑을 담그어 균액을 취한 다음, 스왑을 벽면에 닿게 하여 과량의 균액을 제거함

- 균액을 취한 스왑은 준비된 Mueller Hinton agar 배지 위에서 지그재그로 전후 방향으로 획선 도말함

② paper disc에 시료 물질 로딩(loading)

[paper disc loading]

멸균된 6mm paper disc를 준비하여 균액이 도말된 Mueller Hinton agar 배지 중앙과 가장자리 부위에 disc를 올림. 이때, disc 간 간격은 24mm를 넘지 않도록 하며 한 배지당 8개의 disc를 올림

- 각 disc에 시료 또는 양성대조군 항생제를 20㎕씩 동일 부피를 로딩함. 배지 1개당 총 8개의 disc에 하기의 군으로 나누어 로딩함.

- 균 도말이 균일한 조건에서 진행되고, 재현성 확인을 위하여 해당 시험은 3회 반복 수행함

③ 배양 및 저해환 지름 측정

- 시료 로딩 후 배지는 균주별 배양 온도에서 18시간 이상 배양함

- 미생물 생육 저해환 (inhibition zone 또는 clear zone)의 지름을 측정함

❍ 시험 결과의 예시

3. 항균활성 평가 (최소저해농도시험법)

① 미세 희석 플레이트 (96well plate)에서 시험물질과 양성대조군 항생제를 2배 연속희석물을 준비함

② 멸균 스왑으로 한천 플레이트에서 몇 군집을 취하여 MCFarland 표준을 준비하고 탁도를 맞추어 균액을 준비함

③ 균액을 연속 희석된 시험물질이 담긴 96well plate에 분배한 다음 권장 온도에서 배양함

④ 96well plate를 플레이트 분광광도계 (microplate reader)를 사용하여 625nm에서 탁도를 측정함

⑤ 균 성장이 완전히 저해되는 가장 낮은 농도를 최소저해농도(MIC)로 결정함

❍ 시험 결과의 예시

4. 항균활성 평가 (살균/소독 시험법)

(1) 시험대상 균주 

대한민국약전 일반시험법 중 미생물 한도시험법에 제시된 균주를 참고

(ex) 포도상구균(Staphylococcus aureus) ․ 대장균(Escherichia coli) ․ 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) ․ 바실러스(Bacillus cereus) ․ 살모넬라(Salmonella typhimurium)

(2) 평가

① 시험장소 분리된 공간의 무균시험에 적합한 클린벤치에서 행해져야 하며, 시험에 사용하는 기구들은 멸균상태이어야 한다.

② 시험법

가. 균액의 조제

 가) 시험대상 균주 5종을 각각 멸균된 NB(Nutrient Broth) 5mL가 담긴 round bottom tube에 접종하여 37℃에서 18~22시간 동안 배양한 후, 600 nm에서 흡광도를 측정 하여 균의 배양정도를 확인.

 나) 시험대상 균주 5종의 초기 배양액을 NB 배지(4℃ 냉장보관)로 10배씩 계열 희석하여 균액 mL당 1x10⁵ CFU가 되도록 준비한다.

 다) 균액(1x10⁵ CFU/mL) 0.1 mL를 새로운 eppendorf tube에 넣고 원심 분리(9,300 RCF, 1분)한 후, 상등액을 제거한다.

나. 시험군 및 대조군의 조제

가) 시험군은 균액에 외용소독제 1 mL를 넣고 잘 현탁한 후 실온에서 1~5분간 방치.

나) 대조군은 균액에 PBS(Phosphate Buffer Saline) 완충액 1 mL를 넣고 잘 현탁한 후 실온에서 1~5분간 방치한다.

다. 시험군 및 대조군의 배지 도말

가) 1~5분간 방치된 시험군(균액/외용소독제) 및 대조군(균액) 각각을 원심분리(9,300 RCF, 1분)한 후, 상등액을 제거하고 다시 TSB 배지 또는 PBS 완충액 1 mL를 넣어 침전물을 잘 현탁한다.

나) 가)에서와 같은 조건으로 다시 원심분리를 한 후 상등액을 제거하는 세척 과정을 2회 반복한 다음 최종으로 침전물에 TSB 배지 또는 PBS 완충액 1 mL를 넣어 잘 현탁한다.

다) 나)에서 마련된 균액 0.1 mL씩을 각각 3개 이상의 TSA(Tryptoic Soy Agar, 대두카제인소화한천) 배지에 도말한 후, 37℃에서 20~24 시간 배양한다.

라. 저해율(%) 계산 및 평가

저해율(%)=[대조군 균수(CFU)-시험군 균수(CFU)]/대조군 균수(CFU) X 100

가) 각 군에서 형성된 집락(colony)수를 계수하고, 외용소독제를 처리 하지 않은 대조군과 비교하여 외용소독제 처리군의 저해율(%)을 계산한다.

나) 각각의 균에 대한 저해율이 99.9% 이상이어야 한다.

 

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